GST pull-down是通过以适当标签和目的基因进行融合表达作为诱饵，从非相互作用蛋白的细胞或组织抽提液中钓出与诱饵蛋白相互作用的蛋白的一种技术。GST pull-down在蛋白质领域中主要用于筛选与已知融合蛋白质相互作用的未知蛋白质，及鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用两个方面。主要用于酵母双杂交得到的蛋白质相互作用的验证。GST pull-down在以上两个方面应用得设计和具体操作有所不同，本文主要介绍利用该技术鉴定蛋白质之间相互作用的方法。

一、实验原理

GST pull-down的实验原理是：将目的基因亚克隆到带有GST基因的原核表达载体中，表达出GST融合蛋白(GST-X)。把GST融合蛋白挂到带有GST底物的琼脂糖珠上，然后把另一种含目的蛋白(Y) 的溶液加入其中，由于谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白，如果发生相互作用就会形成GST-X-Y的复合物。这一复合物与琼脂糖珠又结合在一起，被沉淀下来。然后用过量游离的谷胱甘肽洗脱非特异结合的蛋白，经跑胶分离后进行下一步的WB、放射自显影及蛋白质染色分析来鉴定目的蛋白。

二、主要材料

1.谷胱甘肽琼脂糖球珠

2.GST-X融合蛋白

3.原核表达载体pGEX-4T-2

4.TaqDNA聚合酶

5.dNTP

6.T4DNA连接酶

7. 限制性内切酶

8.PCR产物纯化试剂盒

9.结合缓冲液：50 mmol/L Tris pH7.8 、0.15 mol/L NaCl、2 mmol/L Benzanidine Hydrochloride、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT

10.洗脱缓冲液：50 mmol/L Tris pH7.8 、0.15 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、10 mmol/L还原型谷胱甘肽。

三、主要仪器

1.移液器（20 μL、200 μL、1000 μL）

2.制冰机

3.层析柱

4.小型台式低温离心机 1.5 mL离心管

5.恒温隔水式培养箱

6.摇床

四、主要步骤

1.重组质粒的构建与鉴定

根据NCBI上提供的基因序列，利用Primer primer5. 0设计带酶切位点的引物，然后利用PCR扩增获得目的基因的cDNA序列，然后胶回收DNA;限制性内切酶双酶切pGEX-4T-2原核表达载体和所获得的含有目的基因纯化后的DNA,然后对酶切产物进行纯化，用T4DNA连接酶进行连接，将连接后的重组质粒转化至大肠杆菌DH5a中，经过菌液PCR和酶切鉴定正确后，送交公司测序。利用在线软件clustal W 和BLAST对目的基因测序结果与报道序列进行比较分析。

2.融合蛋白的表达和纯化

将上述构建好的重组质粒转化到高蛋白表达的大肠杆菌BL21中(设立空载体对照)，然后用IPTG进行诱导蛋白表达，根据实验需要，需要摸索IPTG的诱导浓度和诱导时间，然后利用超声波破碎细菌，再用SDS PAGE电泳来观察融合蛋白的表达情况，先小量诱导，条件摸索好后再进行大量诱导。用谷胱甘肽琼脂糖珠对所获得的融合蛋白进行亲和层析，纯化后的洗脱液用SDS PAGE进行检测。

3.pull-down实验

当培养瓶中的细胞长至90%汇合时，用胰酶将细胞消化下来，然后用细胞裂解液进行裂解收集蛋白分装成2份后置于超低温冰箱中备用。将含有纯化的融合蛋白的树脂和GST空载体的树脂加人到从细胞中提取的蛋白质中，4°C下旋转2h离心弃沉淀，然后用细胞裂解液洗涤沉淀4~5次，再用PBS洗3次，小心吸尽上清，然后向沉淀中加入4XSDS上样缓冲液，100°C煮沸5min,冷却后离心，取.上清进行SDS PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色观察GST pull-down结果，将正确的目的带用刀片切下，进行蛋白质指纹和质谱分析。