酵母单杂交常见问题

问题1：基因组PCR不能扩增得到DNA片段(酵母单杂交分析诱饵)?

解决方案:当从基因组DNA进行PCR失败时，除去一些一般的 PCR问题(遗忘、污染或者加入错误的试剂)，模板降解是最常见的问题。取几微克基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，确认可以呈现出一个单独的高分子质量的条带(大于20kb)。如果出现了“笑脸型”的条带(尤其小于5kb),则需要更换新的模板。如果模板的质量很好但是PCR失败了，我们需要用一对不同的引物(最好是之前以同样的模板成功进行过片段扩增的引物)来检测是否模板已经被污染或者引物抑制了PCR。我们或许有必要来设计新的引物，如果可以在其他不同的区域来设计引物，则可以将一条或者两条引物相对于原始的位点向上游或者下游移动50~100bp.当确定了引物的大体位置，我们可以在不超过溶解温度的前提下在3端加上或者去除一些核苷酸。
问题2:Gateway反应没有得到细菌菌落？

解决方案:假设:①实验中用了一致的Gateway位点(仔细检查引物的尾端和载体);
②必要的对照显示所用细菌的量是适当的(将已知量的质粒采用相同的转化方法接种在相同的介质上);
③Gateway 所用的酶是起作用的(用与酶一起提供的试剂来检测一下重组)，低质量的Gateway载体(或者在LR反应中入门克隆)会带来一些问题。所有批次的Gateway载体必须经过检测并能在Gateway中发挥作用，而且能转化细菌。
通常来说，准备一个新的小量制备的入门克隆或者用一个可选的入门克隆就可以获得成功，在极少数情况下，在载体上的Gateway位点处会发生突变，我们可以用DNA测序来检测。如果在BP反应中没有加入足够的扩增子，PCR克隆可能会失败。在这种情况下，我们可以扩大Gateway的反应体系来进行更多的PCR。再或者，我们可以提高扩增子的浓度，通过在小体积中重悬后用盐或者乙醇来沉淀，或者在一个新的PCR反应中用0.5μL低浓度的PCR产物作为模板来获得高浓度的溶液。
问题3: Gateway BP克隆可以获得很多包含一些引物二聚体的克隆。

解决方案:有时我们用含Gateway尾巴的引物进行PCR时，在产生我们需要的目的片段的同时，还有引物二聚体形成，因为引物之间也会发生复性。这些包含Gateway位点的短的二聚体片段会优先于大片段插入到载体中。尽管在更多的(约48)细菌克隆中会存在我们想要的克隆，一种去除引物二聚体的办法就是对全基因组的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切出包含目的条带的那一段胶，回收得到DNA后进行后续的Gateway BP克隆反应。
问题4:整合后没有得到酵母的克隆。

解决方案:将每微克DNA加入到200uL足量的酵母中，在得到少于30个整合体的情况下，同时将DNA诱饵和报道基因盒整合在YM4271酵母链上的成功率是很低的。然而，HIS3单独构建的整合率是每微克少于300个，而LacZ构建的整合率可以达到每微克1000个。如果同时构建两个整合体有难度的话，我们可以尝试进行转化，然后将其中的一半混合后接种于150mm 的Sc-His 板子上，将另一半接种于 150mm的Sc-Ura板子上。我们得到的克隆中会产生-一个整合的报告体，在经过自身活化检测和诱饵DNA本底确认后可以与另一个报道基因进行整合( 需要注意的是，这里需要第二轮的自身活化检测和诱饵DNA确认后，酵母菌才可以被使用)。如果只有一个报道基因进行了成功的整合，也就是说最终的整合失败了(切到了同源区域外边或者完全没有切开)。如果两个整合体都没有得到，可能是板子上的介质或者转化过程中出了问题。